cellendes 3D細胞水凝膠系統使用操作步驟

德國cellendes的3D細胞水凝膠系統是一套用于3D細胞培養時構建細胞外基質組分的試劑。使用者可以利用這些試劑控制細胞外環境，設計適合細胞生存的3D系統。

3D細胞水凝膠系統與活體細胞外基質相似，采用該系統可使體外細胞培養更接近體內的生理特征，是基礎研究、藥物篩選和再生醫學等領域細胞功能研究的理想選擇。

一、使用cellendes 3D細胞水凝膠系統時的注意事項：

1. 所有步驟均在無菌環境下操作。
2. 一般選擇使用10x CBpH 5.5，10x CBpH 5.5不適合時，才會使用10x CBpH 7.2 。但是使用10x CBpH 7.2時，凝膠形成的速度很快，降低CB的pH值，可以減緩凝膠形成的速度，可以混合10x CBpH 5.5和10x CBpH 7.2 。

CBpH 5.5和CBpH 7.2混合后CB的pH值（詳見說明書p10）

3. 細胞懸液： PBS或培養基懸液
4.  Mal-PVA或Mal-Dextran溶解后冰浴上使用。溶解后應放于-80℃保存，使用時避免反復凍融，如果短期內使用，可以4℃放置（1周左右）
5. PEG-link和CD-link不要長時間暴露在空氣中

二、使用cellendes 3D細胞水凝膠系統時實驗前準備：

1. 解凍、溶解3D水凝膠組分（詳見說明書），保證全部溶解
2. 如果3D水凝膠需添加RGD肽（詳見說明書）：
A. 用水溶解RGD肽，使終濃度是3.0mmol/L
B. 如需比較RGD肽不同濃度的效果，會使用硫代甘油，需將硫代甘油：水=1：6.7溶解，使終濃度是3.0mmol/L
3. 保證Mal-PVA或Mal-Dextran 冰浴上
4. 準備細胞懸液（PBS或培養液），建議細胞懸液濃度時2-4 x106/ml，使zui終濃度時10000-20000個細胞/30ul

三、無RGD肽時cellendes 3D細胞水凝膠系統實驗操作：

注：需保證馬來酰亞胺基團（Mal- ）和硫醇基團（SH- ）等量
可以預實驗決定凝膠強度

注：CBpH5.5和細胞懸液的量是不變的，為了保證等滲條件

實驗步驟如下：

A．按上表混合水、CBpH5.5、Mal-PVA(或Mal-Dextran)、細胞懸液于一管（管1）中
B．將PEG-link(或CD-link)滴加到培養皿表面
C. 用吸頭吸出管1中的組分，與培養皿上的PEG-link(或CD-link)混合，快速吹打3-4次
D. 避免產生氣泡，放置至少一分鐘（3-5min），等待凝膠形成
E. 一旦凝膠形成，輕輕加培養液至覆蓋住凝膠，蓋上培養皿蓋，至合適的溫度孵育
F. 兩個小時后更換新培養基

四、用RGD肽時cellendes 3D細胞水凝膠系統實驗操作：

一般情況下1mmol/l或低于1mmol/l的RGD肽，就可以提供足夠的粘附力
當需比較RGD肽濃度以及是否需要使用RGD肽時，需用到硫代甘油
下表中列舉的是：馬來酰亞胺基團（Mal--）=硫醇基團（SH--）=5mmol/l，選擇zui合適RGD肽濃度時，需用硫代甘油來調節

 如確定交聯強度是5mmol/l，可按下表預實驗RGD肽濃度

實驗步驟如下：

                     實驗操作示意圖（30ul體系）

A. 按上表混合水、CBpH5.5、Mal-PVA(或Mal-Dextran)、細胞懸液于一管（管1）中
B. 添加RGD肽和硫代甘油于管1中，快速混勻，室溫放置5-10min，有足夠的時間使RGD peptide共價結合到馬來酰亞胺基團（Mal- ）上
C. 將PEG-link(或CD-link)滴加到培養皿表面
D. 將細胞懸液添加到管1中
E. 用吸頭吸出管1中的組分，與培養皿上的PEG-link(或CD-link)混合，快速吹打3-4次
F. 避免產生氣泡，放置至少一分鐘（3-5min），等待凝膠形成
G. 一旦凝膠形成，輕輕加培養液至覆蓋住凝膠，蓋上培養皿蓋，至合適的溫度孵育
H. 兩個小時后更換新培養基

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